抗体辨认SPIKE、免疫吸附ELISA

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Emzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)，又称为酶联免疫吸附分析法，是抗体应用的实验方法之一，主要用来检测抗体与抗原的专一性、亲和力，又或者是样本中特定抗原或抗体的含量等等。实际应用层面广泛、步骤也不复杂，是许多实验室与研究单位常用的检测方法。

ELISA怎么做?

ELISA实验流程可整合为包被(Coating)、封闭(Blocking)、检测(Detection)、读取(Reading)四大步骤:

1. 包被：将抗原或抗体固着在微孔板上。
2. 封闭：阻断非专一结合作用。
3. 检测：利用酵素呈色以检测抗体与抗原的结合。
4. 读取：分析呈色状况以定性定量抗体抗原结合程度。

ELISA也有好几种!?

依实验目的及流程不同，ELISA的应用大致可分为4种: 直接ELISA (Direct ELISA)、间接ELISA (Indirect ELISA)、夹心ELISA (Sandwich ELISA)、竞争ELISA (Competitive ELISA)。(Ref 1)

1. 直接ELISA：先将抗原包被于微孔板上，封闭之后再直接加入酶联一级抗体，洗去多余抗体后加入基质呈色。由于步骤相对简单，在节省实验时间与降低人因失误上较具优势，也能避免二级抗体交叉作用带来的影响。但是直接ELISA也有事前的一级抗体酶联加工费工费时、缺乏实验适用弹性、无法放大讯号与多重标定耗时等缺点。主要用于检测样本中特定抗原定性定量、抗原表位定位以及筛检抗体等用途。
2. 间接ELISA：步骤大致与直接ELISA类似，但由于间接ELISA使用了酶联二级抗体，抗体与抗原的结合讯号得以被放大、敏感度也增加，而且还具有良好的实验适用弹性，是很常被使用的ELISA种类。
3. 夹心ELISA：顾名思义，是将抗原夹于两种抗体之间的方法。先将捕捉抗体(Capture antibody) 包被于微孔板上，封闭后加入抗原与其结合，再次封闭后再加入辨认不同表位的检测抗体(Detection antibody)。依检测抗体是否酶联或使用二级抗体，夹心ELISA也可细分为直接与间接法。由于使用双重一级抗体，夹心ELISA具有相当高的讯号专一性以及实验适用弹性。主要使用于检测大分子抗原，也适用于纯度较低的样本检测，如血液或食物等。
4. 竞争ELISA：主要是利用外加抗原或抗体与事先包被并已结合好的抗体与抗原竞争的方法。随着外加浓度增加，事先结合的抗体抗原会逐步被取代。可以依实验目的酶联于不同的抗原或抗体上，以利最后的讯号解读与比对，适用性相当广泛。主要用来检测样本中的小分子抗原含量或特定抗体含量。

ELISA种类原理图 

GeneTex产品介绍之ELISA的变化与应用

近来GeneTex推出了相当多的感染疾病检测试剂，以SARS-CoV-2的中和抗体检测试剂为例，说明ELISA的实际应用范例。

(1) Omicron变异株中和抗体检测试剂 (SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody ELISA Kit (Omicron BA.1 / BA.2 / BA.4 / BA.5) (GTX537233))

SARS-CoV-2透过棘蛋白(spike protein)与宿主细胞表面的ACE2蛋白结合以进入细胞。中和抗体可以干扰此作用、抑制SARS-CoV-2感染，因此被许多专家认为是病人存活与免疫防护的关键 (Ref 2)。免疫防护的强度与期限对于流行病学研究、公共卫生措施以及疫苗策略制定等是相当重要的议题 (Ref 3, 4)。相对于传统病毒感染抑制法，高通量的免疫分析可以更有效率的协助检测有效的中和抗体并绘制其效力相关曲线 (Ref 5)。

GeneTex新开发的试剂是利用竞争ELISA的原理来检测样本中的中和抗体浓度。包被于微孔板上的ACE2蛋白会先与标记His-tag的棘蛋白结合。值得注意的是，尽管RBD (receptor-binding domain)被认为是棘蛋白用来与ACE2结合的主要区域，但无法排除其他相邻区域以及多体结构对于感染的影响。为了更加贴近真实情况，试剂中采用了三体结构的棘蛋白。当阳性对照组或带有中和抗体的样本加入后，棘蛋白对ACE2的结合将会受到干扰而脱离，剩余的部分则可以被酶联His-tag抗体辨认并用于后续呈色。因此，当中和抗体效力越强、浓度越高，棘蛋白越容易脱落，最终呈色越淡；反之则颜色越深。

GeneTex新型冠状病毒中和抗体酶联免疫吸附检测试剂套组 (Omicron BA.1 / BA.2 / BA.4 / BA.5 变异株) (GTX537233)

检测试剂套组的中和抗体阳性对照组来自于SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody [HL1003] (GTX635792) (104-13333 pM) (左图)以及SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD Omicron antibody [HL1867] (GTX637592) (104-13333 pM) (右图)来自两支棘蛋白受器结合结构域抗体的混合物，不只可以抑制野生株，也能抑制Omicron子变异株(BA.1、BA.2、BA.4与BA.5)的棘蛋白与宿主受器ACE2的结合。

(2) 侧向流动分析 (Lateral flow-based neutralization assay)

侧向流动分析也是广义的竞争ELISA原理应用，也可以用来作为中和抗体浓度检测的工具。棘蛋白与ACE2抗体事先分别包被于快筛试片的测试线 (Test line)与对照线 (Control line)上。当阴性样本加入后，标记胶体金的ACE2蛋白会沿着试片扩散，并被测试线与对照在线的棘蛋白RBD与ACE2抗体拦截，于试片上呈现双红线。当带有中和抗体的样本加入后，原先被拦截的ACE2蛋白则会因为中和抗体的竞争而无法停留形成红线。 

利用侧向流动分析筛检新冠病毒中和抗体浓度。新冠病毒中和抗体能够利用竞争的方式，干扰棘蛋白RBD与ACE2蛋白的结合，而使得测试线(T线)上的胶体金标定ACE2蛋白脱离，而无法呈现红色的T线。反之，阴性对照组则因为胶体金标定ACE2蛋白与棘蛋白RBD以及ACE2抗体的结合，而分别停留在T线与C在线(对照线)。

(3) SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD Protein Sandwich ELISA Kit (GTX536267)

GeneTex设计了一系列针对SARS-CoV-2棘蛋白不同表位的重组单株抗体，这些抗体除了通过专一性验证之外，也进行了不同排类组合的测试，为的是找出最适合应用于直接夹心ELISA的捕捉抗体与检测抗体配对。

SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD Protein Sandwich ELISA Kit (GTX536267) 试剂组中，利用事先包被于微孔板上的棘蛋白RBD鼠单株抗体做为捕捉抗体，与阳性对照组的棘蛋白S1或与样本中的目标抗原结合。在洗去多余的抗原之后，再以酶联抗体进行第二次辨认。依样本中的目标抗原多寡而有呈色浓度的差异。经过充分的实验测试，这组棘蛋白RBD夹心ELISA试剂被证实可适用于辨认SARS-CoV-2原始病毒株以及数种被关注监测的变异株的重组棘蛋白RBD，包括: Alpha (B.1.1.7, B.1.1.7 with E484K)、Beta(B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta (B1.617.2)、Kappa (B.1.617.1)以及Omicron (BA.1, BA.2, BA.4, BA.5, BF.7, BQ.1与XBB)。

夹心ELISA试剂套组SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD Protein Sandwich ELISA Kit (GTX536267) 应用于辨识新冠病毒野生株与不同变异株的重组棘蛋白RBD。

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1. 挂图: 新冠病毒
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6. 单页: 甲型与乙型流行性感冒病毒重组抗体 

参考文献

1. Nat Commun. 2021 May 11;12(1):2670. doi: 10.1038/s41467-021-22958-8.
2. PLoS Med. 2022 May 17;19(5):e1003991. doi: 10.1371/journal.pmed.1003991.
3. Nat Med. 2022 Mar;28(3):496-503. doi: 10.1038/s41591-022-01715-4.
4. J Med Virol. 2022 Jan;94(1):388-392. doi: 10.1002/jmv.27287.