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关于内参你该问的事

28-Jun-2021

什么是内参

Western Blot常用来比较不同条件下或不同细胞组织中目标蛋白表达量的相对多寡,因此必须先确定上样量相同,才有比较的基础。在Western Blot实验中,可能因总蛋白浓度测定不准确;或是蛋白质上样时因操作产生误差,所以必须设置内部参照组来进行校正。此内部参照必须在不同细胞或组织间表达相对恒定,且有高水平的表达量,来确保不同样品间蛋白定量相同。而这样的参照蛋白,就称为内参,对应的抗体就称为内参抗体。

内参在WB实验中的重要性

  1. 用于校正蛋白水平,确保不同样品间蛋白定量(上样量)相同。可从条带粗细初步判定上样量是否有差异。进一步,使用影像分析程序将目标蛋白量除以内参含量,所得到的数值即为校正后的目标蛋白相对含量,如此就可以进行目标蛋白相对量的比较。
  2. 确认转膜、显色等步骤是否均匀转移,呈色。内参一般选用高表达的蛋白,因此也可通过内参的条带, 观察WB实验中的转膜、显色等步骤是否有异常。
  3. 对文章发表绝对重要,增加实验的可信度。文章内放上内参的数据,较有说服力,文献审核者也会较相信实验数据。

如何挑内参抗体

通常会挑选各细胞或组织间稳定表达、并且不受实验影响的蛋白作为内参,但不同的实验还是有一些细节要注意,挑选内参可参考下面四点:

研究的蛋白分子量?

选择内参抗体时,应考虑分子量。内参蛋白最好能与目标蛋白的分子量有5 kDa以上的差异,在WB实验中能做区隔。分子量若太过接近,不利后续条带的分析。例如目的蛋白分子量为34 kDa,则可考虑选择分子量19 kDa 的Cofilin 1,不宜选择34 kDa GAPDH作为内参。

Citation-Support KOKD-Validation Comparable Abs  IP-MS Analysis
Cyclin D1 antibody [N1C3] (GTX108624)

Cyclin D1 antibody [N1C3] (GTX108624)

Brachyury antibody (GTX133714)

Brachyury antibody (GTX133714)

   

研究的領域?

挑选的内参是否会受实验变化影响,例如GAPDH是常用的内参,但在代谢糖酵解的研究中,可能就不适合做内参;在凋亡实验时,TBP、Lamin A + C等与凋亡相关的因子也不适合作为内参。内参最好是选择在正常状态和病理状态下表达没有明显差异的蛋白,这也是大家最容易忽略的一点。

说明:创伤性脑损伤后,GAPDH显著降低,建议以beta actin做内参(PMID: 30077728)

 
GAPDH antibody [GT239] (GTX627408)

GAPDH antibody [GT239] (GTX627408)

   

研究的材料?

  1. 哺乳动物的组织或者细胞样本,通常选择β-actin、GAPDH、COX4、Histone H3等。
  2. 其他来源样本应该参照文献,选择合适的蛋白作为内参,例如植物样本可用bata actin,Ubiquitin,Rubisco作为内参

是否使用亚细胞萃取?

一般的蛋白检测常用β-actin、GAPDH抗体等,如针对核蛋白定量,常用的核内参抗体有Lamin B、Histone H3、PCNA。

常用内参一览表