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Western Blot常用来比较不同条件下或不同细胞组织中目标蛋白表达量的相对多寡,因此必须先确定上样量相同,才有比较的基础。在Western Blot实验中,可能因总蛋白浓度测定不准确;或是蛋白质上样时因操作产生误差,所以必须设置内部参照组来进行校正。此内部参照必须在不同细胞或组织间表达相对恒定,且有高水平的表达量,来确保不同样品间蛋白定量相同。而这样的参照蛋白,就称为内参,对应的抗体就称为内参抗体。
通常会挑选各细胞或组织间稳定表达、并且不受实验影响的蛋白作为内参,但不同的实验还是有一些细节要注意,挑选内参可参考下面四点:
选择内参抗体时,应考虑分子量。内参蛋白最好能与目标蛋白的分子量有5 kDa以上的差异,在WB实验中能做区隔。分子量若太过接近,不利后续条带的分析。例如目的蛋白分子量为34 kDa,则可考虑选择分子量19 kDa 的Cofilin 1,不宜选择34 kDa GAPDH作为内参。
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挑选的内参是否会受实验变化影响,例如GAPDH是常用的内参,但在代谢糖酵解的研究中,可能就不适合做内参;在凋亡实验时,TBP、Lamin A + C等与凋亡相关的因子也不适合作为内参。内参最好是选择在正常状态和病理状态下表达没有明显差异的蛋白,这也是大家最容易忽略的一点。
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一般的蛋白检测常用β-actin、GAPDH抗体等,如针对核蛋白定量,常用的核内参抗体有Lamin B、Histone H3、PCNA。