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Glypican是肝素结合蛋白的协同受体,看似配角的Glypican,近年来却发现有相当的实力成为男一或女一。例如:Glypican 1。
Glypican 1是早期胰腺癌检测的指标,2015年Kalluri教授发现与外泌体的关系,成了大家争相研究的热点。Glypican到底是怎样的一个蛋白?有哪些特点值得关注?
Glypican(磷脂酰基醇蛋白聚糖)是一种崁入膜的蛋白多糖家族,因含有硫酸乙酰肝素(HS)粘多糖(GAG)链,在分类上属于酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)。Glypican蛋白都包含了大小相似的核心蛋白,分子量约在60到70 kDa之间,且通过糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol:GPI)键连接到细胞膜。目前已经有六种Glypican蛋白在哺乳动物中被鉴定出来,称为GPC1至GPC6,依据序列相似性,GPC3和GPC5常被称为一个亚家族,GPC1、 GPC2、GPC4、GPC6构成另一个亚家族。有趣的是,每个Glypican蛋白的氨基酸序列和结构,在物种之间序列具有高度保留性,无论种类如何,所有脊椎动物的Glypican蛋白都有90%以上的相似度,增加研究的便利性。
Glypican蛋白可做为共同受体,当结合配体之后,再与其他受体结合,进而降低配体所需的量,因此在发育过程中扮演重要的角色。
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Glypican也可作为Wnt、Hedgehog信号通路、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor:FGF),及骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein:BMP)信息传导的调节因子,其作用是抑制或刺激特定细胞的分裂与生长。
图说:Glypicans 参予许多信号通路的调控,包含Wnt, Hedgehog,调控细胞生长与分化。
依据组织以及发育阶段的不同,Glypican蛋白表达的量也有所不同,在许多类型的癌症中都可发现Glypican蛋白的表达量异常,包括:人肝细胞癌、卵巢癌、间皮瘤、胰腺癌、神经胶质瘤、乳腺癌,以及最近被发现高表达GPC2的神经母细胞瘤。Glypican仍有许多的机制未被阐述,但大多数的研究集中在与癌症相关的GPC1 、GPC2和GPC3,下面我们就特别介绍这三个蛋白。
GPC1的表达量与胰腺癌、胶质瘤和乳腺癌的肿瘤进展相关,包括肿瘤生长、血管生成和转移,报导指出,胰腺导管腺癌细胞,除了在质膜上过表达GPC1,也会将GPC1释放到肿瘤微环境中,由于Glypican蛋白会与生长因子结合,研究人员推测,肿瘤微环境中GPC1量的增加,可能有助于储存癌细胞的生长因子,通过降低胰腺癌细胞中GPC1的量,可以阻碍癌细胞的生长,因此,病患血液中的GPC1,能够为胰脏癌提供早期的检测,此点也通过在免疫受损的小鼠体内实验获得证实,降低GPC1的表达量,可减缓肿瘤生长并减少血管生成与转移;此外,增加小鼠脑内皮细胞GPC1的表达量,会导致细胞生长,并因应血管生成因子FGF2的刺激而进行有丝分裂,这表明GPC1可作为细胞周期进展的调节因子,在乳腺组织中,GPC1涉及肝素结合与细胞周期进程。
GPC2对神经元细胞粘附和神经突向外生长很重要。大约一半的神经母细胞瘤病例有GPC2蛋白高度表达的情形,与GPC2表达低的患者相比,高GPC2表达与较差的总体存活率相关,表示GPC2可作为神经母细胞瘤的治疗靶标,静默GPC2后,会使Wnt/beta-catenin信息传导失活,并降低靶基因N-Myc的表达。N-Myc是神经母细胞瘤肿瘤发展的致癌驱动因子,因而抑制神经母细胞瘤的生长,目前,已经开发靶向GPC2的免疫毒素和嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor: CAR) T细胞,用于治疗神经母细胞瘤和其他GPC2阳性的癌症。
研究发现GPC3在早期胚胎发育过程中大量表达,对组织的形态发生和生长扮演重要角色。而在肿瘤发展的过程中GPC3也是一个研究热点。研究显示在健康成人肝脏与肠道细胞中检测不到GPC3的表达,而在大多数人肝癌与结肠直肠癌细胞中则会表达GPC3,因此GPC3为肝脏和肠道中的癌胚蛋白(oncofetal protein),也被应用在早期肝癌的检测上。
Glypican因有糖化修饰,做WB实验时分子量可能高于预期,且有多个条带,下面我们用Glypican 1当例子。
人类Glypican 1的前体由558个胺基酸组成(构成约61.4 kDa分子量),包含23个信号肽,507个胺基酸的成熟区段(构成约55.8 kDa分子量),和28个胺基酸末端序列,并且有2个潜在的N-连接与4个潜在的O-连接醣基化位点,此外,Glypican 1还存在一段HS-attachment region,含有51个胺基酸,上面有三个HS修饰,如果此区域被酶切掉,则会产生一个50.2 kDa的蛋白质。一般而言,不考虑醣基化的话,WB实验可能会看见,50.2、55.8与61.4 kDa的片段,如果再加上两个N-端醣基化(一个N-端醣基化分子量约会多2.5 kDa),条带会跳到55.2、60.8与66.4 kDa左右,如果是O-端醣基化或HS链,则会导致70-200 kDa间的拖带出现。
GeneTex的Glypican 1 antibody [N3C3] (GTX104557)结果符合上述规则,且经过敲除敲弱验证、两两抗体比较、加药验证,并适用于多种应用,是你研究Glypican最好的帮手,请参考下面验证。
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