GeneTex中国官方网站
  • China

FAQs & Tips

  • 购买 FAQ
    Q1: 如果我对产品有疑问，可以联系谁?

    为了满足您的需求，请在购买前联系 sales@genetex.com或当地经销商以获取更多信息，我们将帮助您选择最佳产品进行实验。

  • 技术 FAQ

    Q1: 我应该在什么温度下储存我的抗体或试剂?

    Q2: 分装抗体时，每份应该放入多少体积?

    Q3: GeneTex是否提供常见抗体应用的实验方法?

    Q4: 制备做western blot实验的蛋白质样品时，要考虑哪些参数?

    Q5: 我可以重复使用稀释的抗体溶液吗?

    Q6: 为什么western blot 上蛋白质的分子量(MW)与预测的MW不同?

    Q7: 我可以将抗体使用于说明书里未标明的物种或应用吗?

     

    Q1: 我应该在什么温度下储存我的抗体或试剂?

    有关具体建议，请参阅每个产品的说明书。通常，抗体可在4 ºC冷藏短期(1-2周)储存，如果存放时间较长，请将抗体分装，并保存在-20ºC或更低温的无霜冰箱中，避免反复冻融；如果储存不当，可能会影响产品的效能。

    Top

    Q2: 分装抗体时，每份应该放入多少体积?

    可根据实验的要求调节分装试样的体积，但是，由于小体积更容易受到外部温度的影响，我们建议分装试样要> 10 ul。

    Top

    Q3: GeneTex是否提供常见抗体应用的实验方法?

    GeneTex在网站上提供常见应用的实验方法，尽管每个实验室都已经有自己的步骤，但仍然需要对每种抗体/试剂进行优化，请点击此处 click here 查看常规实验方法。

    Top

    Q4: 制备做western blot实验的蛋白质样品时，要考虑哪些参数?

    样品应在含有适当蛋白酶抑制剂(以及磷酸化靶目标磷酸酶抑制剂)的冰冷缓冲液中裂解，始终将样品保存在冰上并冷冻分装试样，以避免反复冻融。

    Top

    Q5: 我可以重复使用稀释的抗体溶液吗?

    GeneTex 无法保证稀释的抗体在重复使用时能够始终如一地发挥作用，这必须由研究人员凭经验进行测试。

    Top

    Q6: 为什么western blot 上蛋白质的分子量(MW)与预测的MW不同?

    蛋白质具有翻译后修饰、切割、同种型或聚合等作用，这些作用会影响跑胶时观测的分子量大小，甚至蛋白的氨基酸组成及构型也会影响。因此，根据感兴趣的蛋白质生物学，可能存在比预期更小或更大的特定条带。相关信息，请参阅我们对观测/预测MW的讨论。

    Top

    Q7: 我可以将抗体使用于说明书里未标明的物种或应用吗?

    GeneTex 无法保证抗体适用于未说明的物种或应用，为确保抗体符合您的需求，请在购买前联系 sales@genetex.com以获取更多信息。

    Top

  • GeneTex抗体的五大策略验证
    GeneTex抗体的五大策略验证

    GeneTex深知值得信赖的抗体是加速实验进行与实验具有再现性唯一且必须的工具，因此GeneTex使用各种验证方式来确认我们的抗体品质, 解决批次再现性与专一性问题，并依据2016年Nature Methods上发表的抗体特异性验证指南，将此五大策略纳入生产验证流程……

    2016 年 Nature 子刊建议的 5 种抗体验证方式，即是挑选抗体的金标准。

    五大验证包含基因敲除敲弱验证、比较抗体验证、免疫捕获与质谱分析、生物特性与正交策略、蛋白过表达策略等验证方式，说明如下：

    一、基因敲除敲弱验证 

    利用CRISPR/Cas9或RNAi等技术，将目标基因敲除或敲弱以验证抗体对蛋白质表现量变化的信号反馈。

    Knockout

    敲除（Knockout）使用 CRISPR/Cas9 将目标基因从整个基因组去除，使目标蛋白不表达，收取此 Knockout 细胞裂解液作为对照组，可确认抗体专一性。

    Knockdown

    敲弱（Knockdown）使用 siRNA 将目标基因静默，基因还在，但蛋白表达量降低甚至不表达。收取此 Knockdown 细胞裂解液作为对照组，可确认抗体专一性。

    基因敲除敲弱验证就是取有表达蛋白的细胞裂解液，跟使用基因技术去除或减少蛋白的裂解液做比较，如果抗体专一性辨识蛋白，应该会出现一个样本有强条带，另一个样本弱（无）条带，如抗体无专一性则条带无变化。

    范例: 白血病标记物-CD44癌症抗体 (GTX628895)

    CD44参与介导细胞存活的迁移、增殖、分化和信号传导途径。GTX628895抗体是小鼠单克隆抗体，使用基因敲除的细胞裂解液进行验证，可看到处理后条带消失，证实抗体特异性辨识 CD44 蛋白，适用多种应用，包括 WB、IHC-P、FACS 和 IP，且被多篇文献引用，为可靠的抗体工具。

    CD44 antibody [GT462] (GTX628895)
    CD44 antibody [GT462] (GTX628895)    

    二、比较抗体验证

    使用两种可识别目标蛋白表面不同抗原表位的独立抗体，并通过对比或定量分析确定特异性。相同靶标、相同处理的样品，理论上抗体辨识的条带位置应该相同。如不相同，可能有其一抗体辨识错误蛋白或是其他原因；另外也可以通过比较找到更高敏的抗体。

    范例: 乳癌标记物-人表皮生长因子受体-2（HER2，也称 Neu 或 ERBB2）(GTX100509)

    临床上 Her2 的检测多采用免疫组织化学法检测其表达水平，也是决定能否使用靶标治疗的依据之一。GTX100509 HER2/ERBB2 抗体使用两个不同的抗体进行比较（如下），确认有一致性的染色图谱，而 GTX100509(左)灵敏度甚至比其他厂家来的更高。

    Her2 / ErbB2 antibody (GTX100509)
    Her2 / ErbB2 antibody (GTX100509)    

    三、免疫捕获及质谱分析

    利用IP/MS分析可直接捕获与抗体直接发生相互作用的目标蛋白以及其所形成的蛋白质复合物，将免疫捕获的目标蛋白进行质谱分析，可确认捕获的蛋白身份是否为目标蛋白，以此确认抗体是否辨识到对的蛋白。

    范例：DNA 修复、基因稳定性及细胞凋亡研究常会使用的 PARP 抗体 (GTX112864)

    GTX112864 PARP 抗体通过免疫捕获及质谱分析验证（PMID：30377371），可进行 WB、ICC/IF、IHC-P、IP、ChIP assay 等多种应用，GeneTex的“PARP antibody [N2C1], Internal”通过了五项“抗体验证支柱”的所有测试，证实其具高质量，高性价比，与高特异性的产品优势。此外，它已在多篇文献中被引用，在不同物种上均能进行DNA修复，基因组稳定性和细胞凋亡方面的研究。

    比较抗体验证
    比较抗体验证
    生物特性与正交策略
    生物特性与正交策略
    基因敲除敲弱验证
    基因敲除敲弱验证
    免疫捕获及质谱分析
    免疫捕获及质谱分析
    目标蛋白过表达
    目标蛋白过表达
    PARP antibody [N2C1], Internal (GTX112864)

    四、生物特性与正交策略 

    生物特性与正交策略是指利用目标蛋白质本身的生物特性作为基础进行定性与定量验证，或使用非抗体依赖方法(例如RNA表达量)，检测基于抗体与生物特性或非抗体定量间的相关性，来验证抗体的专一性，包含：

    1. 使用加药测试；
    2. 以特殊条件处理细胞；
    3. 使用已知具有蛋白高低表达量的样本作为阳性与阴性对照组；
    4. 细胞定位；
    5. 组织专一性。

    范例: 胰脏癌标记物 KRAS (GTX635362)

    当 KRAS 基因突变，细胞分裂将不受控制，形成肿瘤。其中 KRAS G12D 和 G12V 突变占这些变化的 75% 成为研究的热点。在市面上有许多 KRAS G12D 的抗体，选择抗体时可优先挑选经过验证的，如有组织染色的结果更佳，像是GeneTex 的兔重组单抗 GTX635362。GTX635362 RAS（G12D 突变体）抗体通过使用多种细胞及正常与癌组织对照进行正交策略验证；在人胰腺癌细胞系和 PDAC 小鼠模型的 RAS G12D 突变蛋白表现出高度的敏感性和特异性。右图为蛋白印迹（WB）和左图为免疫组化（IHC-P）。

    RAS (G12D Mutant) antibody [HL10] (GTX635362)
    RAS (G12D Mutant) antibody [HL10] (GTX635362)  

    五、目标蛋白过表达 

    利用在细胞中过表达目标蛋白，并收取细胞裂解液后进行 WB 分析，理论上蛋白量增多，抗体辨识后的信号也会增强，因此可确认抗体是否特异性辨认正确蛋白，过表达目标蛋白可作为抗体验证的正控制组。

    范例: 表观遗传学重要蛋白 TET1抗体 (GTX124207)

    TET1蛋白一般在细胞内的表达量较低, 蛋白生命周期也短, 往往不易检测。这时可进一步使用过表达 TET1 的细胞裂解液作对照（下图 B），可看到抗体辨识的条带会明显增强，确定抗体辨识具有特异性。

    TET1 antibody [N3C1] (GTX124207)
    TET1 antibody [N3C1] (GTX124207)

    五项验证要同时通过吗?

    五项验证要同时通过是非常困难的，主要受限于技术与材料，大部分的抗体验证仅能通过 1~2 项的验证，能同时通过 5 项验证可说是少之又少，GeneTex的GTX107678 NFkB p65抗体就是少数的例子之一，该抗体通过 5 项验证方法，并且全面验证 WB、ICC/IF、IHC-P、IP、EMSA，是目前唯一一个能同时通过 5 种验证的 NFkB p65 抗体。

    基因敲除敲弱验证
    基因敲除敲弱验证
    比较抗体验证
    比较抗体验证
    生物特性与正交策略
    生物特性与正交策略
    目标蛋白过表达
    目标蛋白过表达

    注：【免疫捕获及质谱分析】验证数据请参考 Nat Methods 期刊（PMID：30377371）

    GeneTex还有 GTX628887 EGFR 抗体和GTX112864、GTX112839 PARP 抗体抗体都是少数同时通过五种验证的例子。

    EGFR antibody [GT133] (GTX628887)
    EGFR antibody [GT133] (GTX628887)       

     

  • 问题排除技巧下载
     
  • WB问题排除(一)-3个WB遇黑点该做的事
     
     
     
    Western Blot遇到黑点，莫急莫慌莫害怕，只要掌握3个关键问题， 就能完美呈现漂亮Western Blot！
     
     
     解决方案：
    a.确认奶粉完全溶解：
    出现黑点最常发生的原因是奶粉没有完全溶解，建议加入搅拌子，增加搅拌时间，或是溶解后离心取上清液使用。
     
    b.过滤溶液：
    可使用0.45um过滤头过滤BSA或是用滤纸过滤奶粉颗粒或其他杂质。
     
     c.改变缓冲液：
    脱脂牛奶价钱便宜是封闭液的首选，如效果不好可换为成分单一的BSA或Casein。
     
     解决方案：
     使用新鲜配制的溶液 (Running/transfer/blocking/wash buffers)：使用现配或商品化的溶液减少因长菌长霉造成的黑点。
     
     解决方案：
    一般脱脂牛奶中含有casein这种磷酸蛋白，可能会与磷酸化抗体产生非特异性结合，因此，如使用磷酸化抗体，建议用BSA作为封闭溶液，同时洗脱溶液也用TBST，如此可降低黑点或高背景值状况。
     
     
    1.TBST是以Tris为基底，PBST是以磷酸盐为基底的缓冲液，一般可以根据习惯选择TBST或PBST使用，如果是操作磷酸化抗体或是最终显色分析是用alkaline phosphatase (AP)系统时，因为PBST中的磷酸根会干扰，可能造成高背景值或无讯号，建议使用TBST缓冲液，另外，一次的实验中请用一种缓冲系统，不可blocking buffer用PBST，wash buffer用TBST。
     
    2.封闭时一般使用3-5%封闭溶液，依实验特性不同，可做微调；牛奶与BSA的选择也是相同，掌握原则后，再依实验特性做微调，就能快速上手。
     
     

     

  • WB问题排除(二)-3个WB遇过曝该做的事
     
     
    一样米, 养百人, 同样做WB为什么我的结果总和别人不一样？
     
     解决方案：
    a.降低蛋白上样量：
    通常蛋白上样(loading)量为30-50 ug，但有些蛋白表现量较高(如beta actin)，此时可依蛋白表现量，调整上样量。
     
     
     解决方案：
    a.增加抗体稀释倍数：产生过曝时可增加一抗、二抗的稀释倍数。
    b.减少孵育时间
    c.於4℃孵育
     
     
     解决方案：
    a.缩短曝光时间：过曝时可缩短曝光时间，减少过曝的情形。
    b.使用低灵敏度的ECL：过曝现象也有可能是因为化学发光底物过强导致的, 可选用灵敏度较低的化学发光底物来改善。
     
     
     
     说明：
    化學發光底物等級
     
    化学发光底物一般有三种等级，femto(飞克, 10-15g), pico（皮克, 10-12g）, 及plus(低皮克级, 10-12~ 10-9g) ，可依蛋白表达量挑选适合的化学发光底物。
     
     

     

  • WB问题排除(三)-3个WB遇拖带该做的事
     
     
     爱情忌讳拖拖拉拉, 拖拉的条带也让人心里不快, 怎样可以给个痛快呢?用下面的方式即可解决。
     
    泳道的条带之间出现像下雨一样的条纹, 原因是样品有盐类、蛋白、核酸或杂质的干扰，导致电泳过程中的电场改变。
     解决方案：
    a.重新离心样品后取上清液使用
    b.使用较纯的试剂配置细胞裂解液或购买商业化产品
    c.使用Benzonase®核酸酶： Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白样品粘度，减少核酸对跑胶的干扰
    d.全细胞或亚细胞萃取：使用商业化全细胞或亚细胞萃取试剂盒提取蛋白样品，减少配制试剂溶液以及操作中分离不干净的问题
     
     解决方案：
    a.降低蛋白上样量：通常蛋白上样量为30-50ug，但有些蛋白表达量较高(如beta actin)，此时可依蛋白表达量，进行微调。
    b.蛋白变性不完全, 也会使条带成团拖曳；此时，可通过将样品延长加热时间(一般约5分钟)及调整SDS(一般是2 %)比例, 使蛋白变性更完全。
     
     解决方案：
    a.缩短曝光时间：
    过曝时可缩短曝光时间, 减少过曝的情形。
    b.使用低灵敏的ECL：
    过曝现象也有可能是因为化学发光底物过强导致的, 可选用灵敏度较低的化学发光底物来改善。
    ▲化学发光底物一般有三种等级, femto(飞克, 10-15g), pico（皮克, 10-12g）, 及plus(低皮克级, 10-12~ 10-9g) ，可依蛋白表达量挑选适合的化学发光底物。
     
    另外，制备完下层胶后未用水或醇类覆盖胶体，当样品跑到堆栈层和分离层接口时，蛋白质发生沉淀，之后又随着跑胶过程慢慢溶解，也会形成垂直的条纹，此时只要在加入下层胶体前，用水或醇类覆盖压平就可以有好的结果。
     
     
     
    还有另一个与拖带现象类似的宽带。宽带其特征是条带较粗, 不紧实, 但没有雨状的拖尾，常出现在小分子量，建议用Tris-Tricine缓冲液系统取代Tris-Glycine系统。
     
    ▲使用不同成分的胶体进行实验: 一般常用Tris-Glycine系统，另可根据需求或分子量大小调整，例如分子量<15 kDa，建议可用Tris-Tricine。
     
    常用跑胶缓冲液系统：
    Gel type Selection criteria Running buffer
    Tris-Glycine General use Tris-Glycine
    Bis-Tris Small-to-medium protein size MES SDS
    Bis-Tris Medium-to-large protein size MOPS SDS
    Tris-Acetate Large protein size Tris-Acetate
    Tris-Tricine Small protein size Tris-Tricine-SDS
    ▲如已使用建议的缓冲液与跑胶百分比, 仍觉得条带太粗, 也可适时调整跑胶浓度。
     
     
     
     ▲胶体百分比与位置
     
     
     
     ▲已有目标条带, 但觉得条带不够紧实, 可微调跑胶百分比。
     

     

  • WB问题排除(四)-3个WB遇扭曲该做的事
     
     
    扭曲的线条在艺术上, 可以成为毕卡索   扭曲的线条在WB上, 总是让人不好说
     
     
     
     解决方案：
    a.确保APS & TEMED 正常, 并新鲜配置胶体
    APS为起始剂，主要负责提供自由基供胶体进行聚合反应， APS粉末容易受潮，建议置于防潮箱保存，如果发生结块，建议买新的。溶解后的APS溶液，建议分装小量，并存放于-20度，取出后可于4度短暂保存，避免重复冻融，也可避免溶液污染，如胶体聚合不佳，可换一管APS溶液使用，或重新配置新的APS溶液；另外，TEMED为催化剂，如果过期或坏掉，也会影响胶体聚合，建议分装小量，避免溶液因多次取用而污染，APS与TEMED的比例也要根据胶体的浓度或体积进行调整。
     
    b.小心移除齿梳，避免造成凹孔壁歪掉
    c.配完下层胶后，需用水或醇类将胶体压平
    d.胶里面有杂质/气泡：可预先用0.45 um滤纸过滤胶体溶液，混合胶体溶液时，应避免产生空气。
     
     
     
     解决方案：
    a.避免用高电压电泳使胶体过热。 150V,过热有雾气, 80-100V，上胶带短 下层不匀。
    b.空的孔道加sample buffer，使每个孔洞都有样品且盐类成分相近。。
    c.孔洞中有杂质，用高纯度等级的化学药品或用商业化试剂提取蛋白样品，也可以在上样前用跑胶缓冲溶液冲洗加样孔。
     
     解决方案：
    a.胶跟膜没有密合：轉磨時小心滚压胶体，使胶体与膜确實密合
    b.有时出现 2个条带是因为转膜时晃到产生叠影
     
     
    条带呈哑铃状、骨头状或是长角
    出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一，拔完梳子之后，某些孔道凸起不平整，可以试着注意胶体是否凝固完全（确认试剂没问题），拔梳子时注意不要让孔道歪掉，loading前也可以再用running buffer冲洗孔道，另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，或没有溶解，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白因此被推挤到两边。
     
     

     

     
  • WB问题排除(五)-4个WB遇高背景值该做的事
     
     
    Western Blot遇到高背景, 就像深山云雾, 有那么一点朦胧美, 却又想扒开云雾,一窥究竟。遇到高背景，只要掌握4个关键，即可烟消云散条带出。
     
    蛋白质转印到PVDF 膜或 NC 膜后，泳道与泳道间的空隙没有蛋白质；这时我们需要藉由额外的蛋白质缓冲液来填补其空白处。由于抗体本身也是一种蛋白质，因此若封闭作用不足，抗体可能会填进空白处的位置，进而造成高背景的结果。
     
     解决方案：
     
    a.封闭作用不足：这是其中一种可能的原因，提高封闭物浓度可确保封闭液完全复盖转印膜，如使用5% 脱脂奶粉或BSA。
    b.封闭液是否会与抗体反应：这种情况较常发生在磷酸化抗体的使用过程中，由于牛奶含有casein这种磷酸蛋白，因此如果使用牛奶当封闭液，可能会产生封闭液与磷酸化抗体有非特异性的结合。这个情况下，建议使用BSA作为封闭液，同时搭配使用TBST的洗脱液来帮助降低高背景值的状况。
    c.封闭时间不够：增加封闭时间也可以降低高背景值的结果，一般情况会使用室温37度封闭1小时，可视情况调整封闭的条件。
     
    在WB实验时，较常见的transfer membrane是NC膜和PVDF膜；可依据蛋白特性、实验室经费，选择适合自己实验条件的材料。提供NC膜和PVDF膜的比较表：
     
     
     解决方案：
     
    a.没选到适合的膜 : 依据目标蛋白、想要呈现的实验结果及膜的特性，选择出适合实验的材料, 可参考上表。
    b.膜干掉：这也会影响实验结果，产生高背景，建议整个实验过程都须注意让膜保持湿润，特别是PVDF膜。
    c.膜没有完全均匀湿透：PVDF膜较会出现这个状况，使用PVDF膜前，需用100% methanol完全浸润膜。
     
     解决方案：
     
    a.封闭液及抗体交互作用：如同上述提到的，建议更换封闭液。
    b.抗体浓度太高：建议降低抗体浓度，并增加洗涤次数和时间。
    c.一抗孵育的温度：若偏高，抗体容易乱黏造成高背景值，建议4℃孵育过夜。
    d.二抗的非特异性背景：可增加二抗对照，验证背景是否由二抗所致。
    e.洗脱不足：容易造成高背景值，建议增加洗脱液体积和洗涤次数。
     
     
     解决方案：
     
    ECL呈色问题造成高背景值的原因，可能是因为化学显色底物过多；建议按说明书加入适量的显色底物。
    化學發光受質靈敏度：化學發光受質一般有三種等級，femto(10⁻¹⁵g), pico（10⁻¹²g）, 及plus( 10⁻¹²~ 10⁻⁹g) ，可依蛋白表達量挑選適合的化學發光受質。
     
     

     

  • WB问题排除(六)-6个WB遇非专一性该做的事
     
     
     1条2条3条， 到底哪一条是我的目标蛋白？非专一性条带看似复杂, 但只要使用注意2方向6小点, 就能找出问题, 快速解决。
     
     
    WB的结果如果目标蛋白条带下有许多条带，像下图, 有可能是蛋白降解造成的。
     
     解决方案：
     
    a.细胞萃取时要加蛋白质抑制剂或磷酸酶抑制剂避免蛋白降解。
    b.在冰上操作蛋白质实验。
    c.避免重复冷冻解冻样品(建议分装)；建议使用新鲜制备的样本。
     
     
    如WB出现多个条带且与目标蛋白分子量呈倍数增长，有可能是蛋白形成多聚体。
     
     解决方案：
     
    a.如果多聚体是以双硫键键结而成，可使用现配的 DTT / 2-ME并将加热时间延长，这可帮助打断多聚体的双硫键。
    b.建议一并确认煮样本的温度是否足够，若煮样本的仪器是电子显示其加热温度，建议可以增加温度计辅助确认温度确实有达到95-100℃。
     
     
    WB如果出现多条带且没有特定规则, 可进一步查询文献确认蛋白质是否有后修饰、剪切体等。
     解决方案：
     
    a.HIF1 alpha其蛋白的预测分子量是93 kDa，不过由于蛋白后修饰作用的原因，观察到的分子量会在120-130 kDa，也可能会因为不同样本的后修饰作用程度不同，而出现更高的位置。一般判断后修饰分子量的方式会和对照组做比较，其多出来的条带很有可能都是目标蛋白。
     
    ▲GTX127309使用加药处理可看到HIF1 alpha表达量增加, 使用基因静默也可看到信号减弱，证明此抗体辨识的为HIF1 alpha。
     
    b.Caspase 3其蛋白会有剪切体，如果抗体的抗原位置是设计在剪切后的位置，且抗体特性并非只会认别剪切后的蛋白，此时就有可能会同时出现未剪切及剪切的多条带，这些并条带并不是非专一性条带；甚至, 有时这些条带的多寡也会和细胞培养条件有些相关。
     
    ▲在cisplatin处理下, caspase 3出现未剪切及剪切体的多条带。
     
     
    WB结果如果发现泳道和泳道间的缝隙不见了(左图)或出现一团黑(右图)的结果，有可能是蛋白样品过量或一抗浓度太高造成。
     
     解决方案：
     
    a.一般蛋白上样量为30-50μg，如果仍出现此情形，建议可减少上样量。
    b.调整增加抗体的稀释倍率，也可调整孵育时间，并使用4℃孵育的孵育温度。
     
    解决方案：
     
    a.洗涤条件：增加洗膜次数与时间或在洗涤液里改用不同强度的detergent或是增加浓度。
    b.设对照组来确认抗体非专一性结合可能的原因，例如：实验用的细胞样本里是否有高度表达其内生性目标蛋白表现量。
    c.可询问抗体公司是否有任何数据支持其结果。
     
     解决方案：
     
    这种情况通常发生在IP实验里，GeneTex有一系列可避免辨认heavy/light chain的特制二抗，其设计原理是用来辨认native的一抗结构。
     
    ▲EasyBlot二抗与native form的一抗有较好的专一性，可减少辨识膜上的denature form 一抗。
     
     

     

  • WB问题排除(七)-5个WB遇信号微弱该做的事
     
     
     
    解决方案：
    a.目标蛋白是否有细胞器特異性? 可提取特定细胞器增加蛋白浓度；例：抽取核蛋白、膜蛋白、质蛋白。
    b.目标蛋白是否有组织特异性? 有些目标蛋白只会在特定的组织表达，这可降低样本挑选的错误率。
    c.目标蛋白是否有后修饰作用? 目标蛋白后修饰分子量会变大，使抗体认到的位置比估算分子量高。
    d.确认目标蛋白在细胞株的表达量以及是否需加药活化蛋白表达。
    e.文献较少的目标蛋白，可参考其mRNA的表达量，寻找mRNA表达量较高的细胞株进行实验，不过须注意mRNA和蛋白的表达量不一定是正比关系，或许可以挑选组织样本和细胞株一起比较。
    f.参考抗体厂商提供的产品信息，例如：抗体测过的样本当作阳性对照，可作为操作问题或是蛋白不表达的依据。
     
    一般蛋白上样量为20-30μg/孔, 如文献已表明目标蛋白表达量低或是使用极少的上样量(例如< 10μg), 需增加上样量来协助抗体侦测其信号。
     
    蛋白质降解可使条带变弱甚至无法重复之前的结果(如下图)
     
    为避免这个情况的发生，可使用以下的方法来避免：
    a.细胞萃取时要加蛋白质抑制剂或磷酸酶抑制剂，避免蛋白降解。
    b.在冰上操作蛋白质实验。
    c.避免反复冻融样品(建议分装)。
    d.新鲜制备新一批的样本。
     
     
    解决方案：
    a.增加抗体量, 例如原本使用1:1000稀释, 调整为1:500稀释。
    b.增加孵育时间：将原37度孵育1小时改成4度孵育过夜。
    c.确认抗体有没有异常, 例如: 重复使用太多次, 失去活性；NaN3加到二抗缓冲液里会降低呈色剂灵敏度。
     
     检查二抗与一抗种属是否有正确配对，要诀: ”鼠配鼠兔配兔, isotype相配不出错”。
     
    降低清洗次数与时间：一般清洗三次, 每次5-10分钟即可。
     
     
    解决方案：
    如果转膜方向错误会让蛋白会往反方向移动进而散逸在transfer buffer里，方向正确才能让蛋白黏附在transfer membrane的孔洞。
     
     如果使用PVDF膜，需先浸MeOH使膜活化才能使用。
     
    a.大蛋白: 转膜条件可调整为低温过夜(湿式transfer)。
    b.小蛋白: 可更改使用 0.2 μm 的transfer membrane，并缩短转膜时间。
     
    转膜后，需使用丽春红(Ponceau S)等染剂染膜确认转膜效率，如下图：
     
     
    解决方案：
    a.降低封闭液浓度：一般使用3-5%的牛奶或BSA做封闭液即可。
    b.降低封闭时间：一般封闭时间为30-60分钟。
    c.抗体如跟封闭液交互作用，也可能因抗体被中和而造成白片，此时可换封闭液解决，例如使用commercial Blocking Reagent (GTX30963)可协助避免这个问题的发生。
     
     
    化学发光底物失活，也可能导致条带变弱。
    解决方案：
     
    a.使用现配的化学发光底物, 避免失活。
    b.使用高敏感度的化学发光底物，例如使用 femtogram (GTX14698)等级的化学发光底物。
    c.延长压片时间。
     
     
     

     

  • IHC问题排除(一)-6个IHC型态不佳该做的事
     
     
     
    解决方案：
    a.使用新鲜配制、适当带电(如: Poly-L-lysine)或疏水(如: Silane)处理过的载玻片(处理方式不同对组织的贴附效果也不同)。
    b.石蜡切片贴于载玻片后，于60°C烘烤3-5小时最为合适，烘烤不足容易掉片。
    c.过程中轻柔冲洗载玻片上的组织。
     
     
    解决方案：
    a.切片刀钝或是刀刃上有缺口：使用锋利刀片重新制备切片。
    b.刀刃上有蜡屑的积留：随时将废屑残渣用毛刷清除干净。
    c.刀没夹紧或刀的角度倾斜：适当调节切片刀的角度，并确认刀片和蜡块都有夹紧。
    d.移动刀座，如果划痕还是出现在相同位置，应该是组织标本内有污物或硬物的问题。
    e.确认组织无过度脱水，并调节适当切片速度。
    f.在分析实验结果时，避免损坏切片区域。
    g.避免展片时于载玻片上形成的气泡。 
     
     
    解决方案：
    a.制备较薄的切片：一般来说，冰冻切片的片子较厚(约10-30 um)，一般设定刀片温度为-10~-20度，如设定太冷，可能会切不好；石蜡切片的片子较薄(约5-10 um)。
    b.确认已使用适当厚度的盖玻片(通常，生物物镜设计的盖玻璃厚度为0.17 mm)，如使用油镜一定要滴油。
    c.建议使用激光共聚焦显微镜成像，去除非焦点平面的噪质。
     
     
    解决方案：
    a.如使用4 % PFA，一般建议至少固定6小时以上，18~24小时已可满足大多数实验应用，可依据染色结果增加固定时间与/或加入后固定的步骤，注意：如固定时间到了无法继续后续脱水、包埋程序，一定要将组织置换到PBS保存，切勿一直泡于固定液中。
    b.增加固定液/组织比例，建议固定液体积至少要是组织块的20倍体积。
    c.准备较小的组织块(约3-4 mm)，以迸行更完全的浸润固定。
     
     
    解决方案：
    a.凭经验决定保留组织型态的条件，同时恢复抗原的免疫反应性：理论上温度越高，酸碱值越碱，但可能造成较高的背景值或组织型态破坏，因此，建议从92°C, pH6开始尝试，pH6的抗原修复液即适用于大多数抗体。
    b.使用冰冻切片样本：冰冻切片一般不做抗原修复，因为抗原修复方式对冰冻切片可能太过强烈，也不需脱蜡、覆水等步骤，能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性。
     
     
    解决方案：
    a.防止组织中冰晶形成：
    -速冻使组织温度骤降, 减少冰晶的形成。
    -固定后将组织置于20％～30％蔗糖溶液1～3天, 利用高渗吸收组织中水分, 减少组织含水量, 可防止或减少冰晶的形成。
     
     

     

  • IHC问题排除(二)-6个IHC高背景值该做的事
     
     
     
    解决方案：
    a.尝试用非醛类替代醛类：Glutaldehyde自发荧光强，较常被用来做以电子显微镜显像的组织样品固定，组织荧光染色不建议使用。
    b.用淬灭自发荧光的染料或方法处理组织样品：如硼氢化钠、短波长的UV照射、苏丹黑等。
    c.将石蜡包埋样品的方法换成制作冰冻切片，减少固定液的影响。
    d.选择一个不会与自发荧光竞争的荧光染料：福尔马林、PFA或Glutaldehyde等会产生高背景的荧光，尤其在使用绿色、蓝色和红色波长光谱范围时；组织中的红细胞或胶原蛋白等组分会产生很强的自发荧光，尤其是使用绿色和红色通道的荧光检测时。
    e.组织冲洗不彻底，有固定液残留。
    f.使用福尔马林或PFA固定过久：一般建议至少固定6小时以上，18~24小时已可满足大多数实验应用，注意: 如固定时间到了无法继续后续脱水、包埋程序，一定要将组织置换到PBS保存，切勿一直泡于固定液中，否则有可能造成蛋白交联无法修复。
    g.配置新鲜的固定液。
     
     
    解决方案：
    a.增加封闭液浓度、延长封闭时间。
    b.更换封闭液成分，注意: 封闭液成分不可与一抗物种同来源，最好与二抗物种同源，如二抗来自马血清，使用马血清可得到较干净的背景。
     
    c.底物过量：缩短底物孵育时间。
    d.信号过度放大：缩短信号放大试剂孵育时间。
    e.洗脱液不适合：如果原本是用PBS，可更换使用TBS。
     
    解决方案：
    a.降低抗体浓度，如1：100调整为1：1000。
     
    b.缩短抗体孵育时间，并在4°c 孵育切片。
    c.二抗交叉反应：做多个目标蛋白染色时, 使用预吸附二抗减少与其他物种一抗的交互作用。(预吸附抗体在制造过程中增加过滤程序, 因此不与其他物种一抗结合)。
    d.二抗与组织发生非特异性结合：每次实验都要设置一组不加一抗，只加二抗的对照组，才能确认信号是来自高背景值还是真实信号。
     
    e.非特异性蛋白与抗体结合: 选择通过严格验证策略验证的GeneTex一抗 。
     
     
    解决方案：
    a.使用酶抑制剂。
    - 过氧化物酶：使用 H₂O₂ (0.3% v/v)
    - 碱性磷酸酶：使用 Levamisol (2 mM)
     
     
    解决方案：
    a.与 Avidin 孵育以封闭生物素。
     
     
    解決方案：
    a.脱蜡不完全：可能导致细胞核染色在呈相时模糊，亦可能导致抗体无法辨认抗原或者高背景值。
     
    b.抗原修复方式不适合：更换修复溶液成分或方法。
     
    c.一抗与组织物种同源：较常发生在使用鼠源抗体染鼠源组织时，除了避开同样物种来源的一抗和组织之外，也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色试剂盒 (GTX83396) 迸行实验。
     
    d.任何时候都不要让组织干掉。
     

     



  • IHC问题排除(三)-4个IHC讯号微弱该做的事
     
     
     
    解决方案：
    a.一抗二抗未匹配：使用针对一抗物种来源的二抗 (如一抗来自兔子，则须使用抗兔子的二抗。
    b.使用的抗体可能不适合用来做IHC：在非変性 WB 上测试抗体, 以确保抗体识别非变性抗原，或是选用通过IHC实验验证的抗体。
    c.没有添加足够的抗体：增加抗体浓度，加长孵育时间，一般建议在4°C过夜孵育。
    d.抗体失活：避免将标记荧光基团的二抗放置于光照环境。
     
    解决方案：
    a.显色溶液失去作用：通过将二抗标记酶, 取一滴与底物溶液反应, 可确认显色溶液是否失去活性。
    b.错误的激发波长：确保激发波长与使用的荧光基团相匹配。
     
    解决方案：
    a.脱蜡作用不足：加长脱蜡时间，使用新鲜配制的二甲苯。
    b.固定液（福尔马林或 PFA) 可能改变表位：利用抗原修复方式使表位暴露出来或缩短固定作用的时间。
    c.固定作用不适当：避免延迟固定或过度固定，一般建议至少固定6小时以上，18~24小时已可满足大多数实验应用。
    d.冰冻切片样品保存期过长：冰冻切片制备完成后，最好于1-2个月内用完，超过6个月的话，建议制备新的玻片。
    e.荧光染色样品保存不当：荧光基团在光线下暴露时间过长，可能会导致信号衰减，除了在避光环境下进行实验和保存样品，也可使用防荧光淬灭的溶液封固样本，如GTX30920与GTX30921 FluoroShield Mounting Medium，是封片剂也具有复染功能，在做复染的时候，连片子都封固好了，下图皆为使用GTX30920封固的玻片影像。
     
    解决方案：
    a.靶蛋白含量低：设置表达量高的组织作为阳性対照组，或利用扩增步骤来放大信号。
    b.靶蛋白为核蛋白：在封闭溶液与抗体稀释液中加入细胞破膜试剂，以促进抗体渗透到细胞核(应针对每种靶标调整最佳的破膜方法)。
    c.膜蛋白被破坏：将缓冲液中的细胞破膜试剂减少或移除(应针对每种靶标调整最佳的破膜方法)。
    d.较厚的组织，如斑马鱼全胚胎或染色建议做细胞破膜，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合(应针对每种靶标调整最佳的破膜方法)。
     
     关键步骤：
    在每次的实验中，设置阳性与阴性对照组，以确认是该次实验的抗体、试剂、组织切片、实验过程的问题，还是目标蛋白本身表达量低的问题。
     

     

  • ICC问题排除-细胞染错位置, 原来搞错这事

    「文献说这目标蛋白应该染在细胞质, 怎么我就染在细胞核, 到底哪里出错呢?」相信这是许多人做细胞染色会遇到的问题, 染色不仅要染的漂亮, 还要染对, 没有些技巧可是很容易失败的。

    　　免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）为常用的实验方法，主要样品为细胞，因常使用荧光标记所以在应用上常常写成ICC/ IF。相对的，免疫组织化学（IHC）样品为组织，可使用荧光或化学方式呈色。细胞免疫染色步骤如上图，需将细胞固定在盖玻片上经过通透、一二抗染色等步骤, 最后成像拍照。当ICC染色定位不正确怎么办呢?莫急莫荒莫害怕 1. 可检查细胞爬片与2. 检查固定与通透。

    ICC型态不佳/信号定位不正确怎么办呢? 检查这2件事，一切都搞定!

    重点1: 细胞黏附好，型态才会好

    a.盖玻片处理: 通常细胞在盖玻片上黏附能力都不强，可以使用几种成分铺在盖玻片上，以增强细胞与玻璃盖玻片的黏附，常用的溶液成分如下表，不同的细胞需进行个别的调整，以得到最佳的结果。

    一般药品 细胞外基质蛋白
    Poly-lysine (0.05-0.1 mg/ml) Laminin (0.05-0.1 mg/ml)
    Poly-ornithine (0.1 mg/ml) Fibronectin (0.05-0.1 mg/ml)
    HCl (0.1-1 M) Gelatin (0.1%)
    Collagen (0.05-0.1 mg/ml)

     

    b.细胞状态和细胞密度: 细胞的健康状态、型态与密度，可能会影响靶标蛋白的表达与定位，一般使用分盘后培养隔夜(时间太短细胞贴附不完全，太长细胞会太老不健康)，细胞密度约50-70 %的爬片，密度太高或太低都可能对靶标蛋白的定位产生负面的影响，需要根据靶标特性调整适宜的细胞类型与密度，例如在研究细胞连接标记蛋白时，维持细胞与细胞间的接触就特别重要，选择较容易观察到细胞连接的细胞种类，最佳细胞密度也要有80%以上。

    N-Cadherin antibody (GTX112734)

    c.细胞培养条件: 有些靶标蛋白的表达和定位，随着细胞周期或细胞应激反应而变化，须确保用来制作爬片的细胞状态为观察靶标蛋白的最佳条件，例如观察细胞分裂相关蛋白，可将细胞做同步处理，使细胞处于同一个细胞周期阶段，否则就需要在细胞爬片中仔细观察靶标蛋白的信号，又如观察自噬反应中的LC3B蛋白，如未加入诱发细胞展开自噬的药物，将较难观察到正确的定位结果。

    Aurora B antibody (GTX132702)

    LC3B antibody (GTX127375)

    重点2: 悬浮细胞染色有诀窍

     a.分盘时，将细胞悬浮溶液接种于涂层处理过的盖玻片上，接着即可比照黏附型细胞的实验步骤。

    RIP3 antibody (GTX131188)

    b.在细胞悬浮溶液中进行完固定步骤，利用细胞离心技术(CytospinTM)将细胞低速离心至涂层处理过的盖玻片上，也可以用移液管吸取细胞悬浮液滴于已涂层的盖玻片上。

    c.在悬浮状态中进行完所有染色步骤，最后用移液管移至器皿或载玻片上进行显微镜成像。

    d.小星狮小技巧: 可以将固定后的悬浮细胞溶液与2-3 % 的琼脂等比例混合，将细胞检体包覆，待琼脂胶体凝固后，再按照常规的脱水、包埋程序做石蜡包埋，制作成的细胞蜡块，之后再进行组织切片，此玻片样本可照一般石蜡组织切片IHC的操作方法进行免疫化学染色，与一般ICC最大的不同为: 此组织蜡块制作的玻片需烤过，再进行脱蜡与回水，也需要进行抗原修复的步骤，基本上是当作IHC进行实验，对于较难得到的细胞样本(如病毒感染的细胞)，可用此方法保存细胞蜡块，日后若有需要只要进行切片即有样本。

    Tristetraprolin antibody (GTX130974)

    Dengue virus NS1 protein antibody (GTX124280)

    　　样品的固定与通透对实验结果影响很大，最适合的固定与通透方法，与细胞类型、靶标蛋白和使用的抗体有关，尝试不同的固定和通透条件，将有助于得到靶标蛋白在抗体染色的最佳信号与正确定位。

    a.固定剂的选择: 固定剂主要有两大类，交联剂(如多聚甲醛)与有机溶剂(如甲醇或丙酮)，交联剂通过疏水性交联把蛋白与蛋白连起来，有机溶剂能使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上，也具有细胞通透的性能，多聚甲醛、甲醇和丙酮等都是很常用的固定剂，建议最初从4% PFA，固定15分钟开始尝试，倘若没有达到预期效果，再调整固定时间或更换另一种固定剂，GeneTex在固定剂的使用经验整理如下表，但仍须根据靶标蛋白或抗体的不同逐步调整出最佳方案。

    靶标蛋白类型 较适合固定剂
    细胞膜 交联剂
    细胞质 交联剂/有机溶剂
    细胞骨架 有机溶剂/交联剂
    高尔基体 交联剂/有机溶剂
    细胞核 交联剂
    细胞核膜 有机溶剂/交联剂
    细胞核仁 有机溶剂
    内质网 交联剂
    中心体 有机溶剂
    纺锤体 有机溶剂/交联剂
    溶酶体 有机溶剂/交联剂
    线粒体 有机溶剂
    自噬体 有机溶剂
    翻译后修饰化靶标蛋白(PTM)  交联剂

     

    mTOR antibody [C3], C-term (GTX101557)

    MUL1 antibody (GTX112673)

    LAMP3 antibody (GTX112715)

    b.通透条件的选择: 由于抗体无法直接穿过数十微米的细胞质膜进入细胞，因此，检测胞内的靶标蛋白时，需进行通透化处理，利用除垢剂在细胞膜形成孔洞，使得抗体得以进入细胞内，常用的除垢剂有Triton® X-100, NP-40, Tween 20或皂甘等，建议从0.1 % Triton® X-100，通透5分钟开始尝试，倘若没有达到预期效果，再调整通透时间或通透剂浓度，也可以考虑更换另一种通透剂，有机溶剂固定剂会引发细胞变性脱水，因此也会破坏细胞膜的完整性，较不适合细胞膜靶标蛋白染色，一般来说，有机溶剂固定之后也不建议进行细胞通透的步骤，最佳的细胞通透方法，一样需要根据靶标蛋白与所使用的抗体而调整，无法用一种方法套用到所有的实验。

    CD45 antibody (GTX116018)

    TDP43 antibody (GTX114210)

     

  • 少了它, 你的实验结果还可信吗？

            良好的实验设计是获得准确科学实验数据的关键，设计正确的同型对照抗体，可以优化实验的结果和去除假阳性，使数据可进一步统计与分析。究竟什么是同型对照呢？我们从抗体开始讲起。

            抗体(Ab)也称为免疫球蛋白(immunoglobulin ,简称Ig)，是一种由B细胞分泌的大分子Y字型蛋白，被免疫系统用来中和细菌、病毒等病原体。抗体「Y」的基本单元为两个大的重链(~50 kDa)和两个小的轻链(~25 kDa)，两条重链和两条轻链通过二硫键连接，组成约150 kDa的免疫球蛋白单体(图一)。每条重链或轻链都由两个区域组成: 恒定区域(C)和可变区域(V)(如图二)。可变区位于「Y」末端的轻链和重链上，不同抗体之间，此区氨基酸序列差异很大，使抗体具有结合并中和抗原的特性；恒定区在同类别的抗体分子中具有相似的氨基酸序列，主要功能是和补体结合与FcR (Fc受体)相互作用。若使用木瓜蛋白酶可将抗体切割产生两个部分，一个是包含抗原结合位置的Fab (抗原结合片段)；另一个是包含部分恒定区的Fc (抗体可结晶片段)。Fab是抗体上与抗原结合的区域，它由重链和轻链各自的一个恒定区和一个可变区组成，这些结构域在单体的氨基酸末端形成抗原结合位置；Fc是抗体的尾端，与称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的一些蛋白质相互作用，使抗体可以激活免疫系统。

    (图一)

     

    (图二)

     

            抗体有许多不同的种类，在胎盘哺乳动物中(如人类与小鼠)，有五种类别(isotype或class)的抗体，称为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE (图三)，他们各自以「Ig」为前缀命名，代表免疫球蛋白，「Ig」之后表示抗体不同类型的重链，特定类别的表达通过与不同免疫效应细胞上的Fc受体分子的特异性结合来确定抗体的功能(表一)，而相同类别也可能存在不同的亚类，如在人类中，IgG具有四种亚类IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，它们对于鉴定和清除肽和多糖抗原至关重要。

    (图三)

     

    (表一)

     

          在实验中，抗体除了与抗原结合外，由于Fc受体或其他蛋白质相互作用，抗体可能以非抗原依赖方式结合，因此确保信号为抗体-抗原特异性结合所产生非常重要。

            同型对照指使用与特异性一抗相匹配的抗体作为对照组，此抗体包括种属、亚型，重链和轻链的类型甚至标记物、浓度应该与特异性一抗相同，但不会辨识特异性蛋白的抗体。同型对照是阴性对照，在使用单克隆抗体(mAb)做研究时，为了准确测量抗体的作用和功效，需使用同型对照以确认信号不是与Fc受体或其他非特异性蛋白结合所产生，让研究人员能够准确的区分非特异性背景信号和特异性抗体信号。一般而言，抗体在结构上彼此非常相似，在抗体分子的「恒定区」(图二)，同类型的抗体彼此序列更是高度保守，然而，单抗的高度可变区只要一个小改变就可以影响抗原的特异性结合。在研究中使用抗体进行测试时，需要控制任何可能影响研究结果的变量，抗体恒定区和Fc区的非特异性结合，这些因素可能会对单抗结果产生影响，因此，在实验设计中需要考虑这些因素，使用匹配的同型对照(具有与测试单抗相同的宿主物种、同型、标记物、轻链和浓度)，以判断这些变量，进行校正与精确的数据分析。相较于以PBS做对照，PBS这样简单的阴性对照无法判断上述变因造成的影响，从而出现误导性数据。

     

     

    1.流式细胞实验 (FACS)： 流式细胞仪可对细胞进行定量分析和分选，抗体是否特异性结合影响最终的实验数据。在流式实验中，抗体可通过与Fc受体或其他蛋白质结合而产生非特异性信号，由于Fc受体的表达随组织细胞类型不同而变化，这种非特异性信号可能产生假阳性，从而混淆了研究结果，此时使用同型对照可确保信号的真僞。匹配的同型对照应能模仿这种非特异性结合和信号，这与使用PBS (无结合)不同。阴性对照应匹配种类、重链、轻链、所需的荧光标记物等，由于这种复杂性，流式细胞实验中使用的同型对照抗体较难挑选也常常引起争议。

    2.免疫组织化学染色(IHC)：做免疫组化实验时，抗体除了与特异性蛋白结合外, 也有可能与组织上的Fc受体结合，导致非特异性染色结果(如图四)。同型对照是免疫组化的重要阴性对照组，一般可使用与一抗相同的同种型和浓度作为同型对照。有时，也会使用二抗或与一抗相同物种的多克隆抗体库染色做阴性对照，然而，使用二抗做对照组无法呈现一抗所造成的背景值，二抗同种型也可能导致染色上的差异；若使用多克隆抗体库做阴性对照进行染色，此抗体库为免疫球蛋白的混合物，可能存在与多种不同靶标结合的风险，而增加背景和非特异性染色。因此，这两者模式与同种型抗体对照不同，不能完全取代。

    (图四)

     

            研究级同型对照抗体适用于基础研究实验，例如免疫组化、免疫沉淀(IP)、流式细胞术、ELISA和蛋白质印迹(WB)。然而，因同型对照抗体无法测量内毒素和纯度，并且包含防腐剂，因此不用在体内实验。在进行实验时可依应用选择适当的一抗，对应(表二)挑选经验证高质量的同型对照，将比二抗或PBS更容易判断一抗是否造成背景值。

    (表二)

     

    更多同型对照抗体

     

     

  • 抗体挑选
    header
     
     
    1.要抓谁？目标蛋白特性
     
    挑选抗体时要先了解目标蛋白特性，才能挑选到适当的抗体。蛋白的特性可从物种、修饰化、亚型、抗原区段、生理环境五个方面进行确认。
    ∎物种：
    许多蛋白具有物種同源性，因此抗体可和不同物种的同源蛋白结合，例如大部分物种的actin序列相近，抗体可以跨物种进行辨识。但并非每种蛋白跨物种时抗体仍能辨识；因此，使用抗体前需先确认抗体可辨识的物种，如物种较特殊，也可联络厂家进行序列比对。部分产品序列可能为商业机密，此时可提供研究的序列给厂家进行确认。
     
     
     
    ▲说明：抗体辨识蛋白质直线型序列 (连续序列) 适用WB, IHC-P, IHC-Fr, ICC, ELISA, IP
         
    ∎后修饰：
    蛋白具有许多修饰化，如磷酸化、甲基化、糖化等，不同的修饰化，会使WB跑胶时条带的位置与预期分子量不同，挑选抗体时可先了解蛋白修饰化对分子量的影响，减少误判。
     
         
    ∎亚型：
    许多蛋白具有亚型，不同亚型功能可能不同。因此挑选抗体时需确认研究的蛋白是否有亚型，研究主题是否需对特定亚型进行辨识？如有特定亚型的需求时，可查看产品说明书，确认抗体辨识的是保守序列(conserved sequences)还是只针对特定亚型进行辨识。
    ▲说明：抗体辨识蛋白质直线型序列 (连续序列) 适用WB, IHC-P, IHC-Fr, ICC, ELISA, IP
     
    ▲说明：抗体辨识蛋白质直线型序列 (连续序列) 适用WB, IHC-P, IHC-Fr, ICC, ELISA, IP
     
    ▲说明：抗体说明书可查找抗体辨识的抗原区段(GTX104763, PD-L1 antibody)。
     
     
     
    GTX104763 PD-L1 antibody
    ▲说明：只辨识PD-L1，不会认到PD-L2 另外，如研究主题为切割后的活性蛋白，也可查看抗体是否是辨识活化后的蛋白。
         
    ∎生理环境：
    有些蛋白需在特定生理条件才会表达，如发炎、自噬等，或是仅在特定细胞器，甚至特定细胞或组织才可观察到；因此，挑选抗体时，应先确认蛋白表达的时机及细胞组织的分布，掌握这些信息， 再查看抗体是否有对应的验证, 有助于挑选正确的抗体 。
     
     
    2.谁去抓？一抗特性
     
    确认目标蛋白信息后，接着可从验证方式与纯化方式来了解抗体的质量。
    ∎GeneTex 5大抗体验证：
    使用CRISPR/Cas9或RNAi等技术，将目标基因敲除或敲弱以验证蛋白质表达量产生变化时, 抗体对应的信号反馈。
    使用2种(或以上)可识别目标蛋白不同抗原决定簇的独立抗体，通过对比或定量分析确定特异性。
    以生物特性作为基础, 进行定性与定量验证，甚至使用非抗体依赖方法(例如RNA表达量)来检测抗体与生物特性或非抗体定量间的相关性。
    为确认抗体侦测的信号为目标蛋白, 使用过表达目标蛋白作为抗体验证的正控制组。
    使用IP-MS分析，可定义与抗体发生交互作用的目标蛋白为何，以及其所形成的蛋白质复合物。
     
    ∎抗体种类：

    ⓐ单克隆：专一性高, 灵敏度较多克隆低

    ⓑ多克隆：灵敏度高, 批次差异较大

    ⓒ重组单株抗体：批次差异小
     
    ∎抗体纯化方式：
    -未纯化
    ❶血清：未经纯化的血清, 含有识别抗原的抗体，也有其他非专一的抗体，成分较复杂, 以血清进行实验一般较容易有杂讯，在说明书纯化方式标示为”Serum”。此形态常出现在多克隆抗体。 例如：GTX11136 GAP43 antibody
    ❷细胞上清液：单克隆抗体的杂交瘤经细胞培养后，会释放抗体在培养液中，收取此培养上清液可获得抗体，在说明书纯化方式标示为”Culture Supernatant或Cell Supernatant”。此形态常出现在单克隆抗体。 例如：GTX78213 GAPDH antibody [1D4]即为上清液形式的抗体。
    ❸腹水：单克隆抗体的杂交瘤打入小鼠的腹腔(或与杂交瘤相同的物种)后会产生腹水，此腹水含有高浓度的抗体，在说明书纯化方式标示为”Ascites”。此形态常出现在单克隆抗体。 例如：GTX11178 S100 beta antibody [SH-B1]
     
    -纯化(血清细胞、上清液、腹水可进一步通过纯化，增加抗体的纯度，一般常见的方式有ProteinA/G和亲和层析)
    ❶Protein A/G：金黄色葡萄球菌蛋白A跟链球菌蛋白G与免疫其蛋白的Fc区域有高度亲和性，可去除其他蛋白，纯化出免疫球蛋白。在说明书纯化方式标示为”Protein A /G purified” 例如：GTX627420 TET1 antibody [GT1462]
    ❷亲和层析：抗原亲和层析纯化方式是利用抗原来纯化抗体，可过滤非特异性的抗体与其他蛋白，得到特异性的抗体。纯化方式在说明书标示为”Purified by antigen-affinity chromatography”。例如：GTX112864 PARP antibody [N2C1], Internal
     
     
    3.被谁抓？二抗特性
     
    二抗可与一抗结合，其后接有酶标或荧光素呈色，可用来放大讯号。二抗挑选要注意与一抗配对，呈色和交叉反应。
    ∎二抗与一抗配对：
    二抗选择最重要的原则，兔配兔，鼠配鼠，isotype相配不出错。例如你的一抗物种是小鼠IgG1亚型，那么二抗就选抗IgG1的二抗。如果只知道物种，但不知道亚型，也可选不分亚型的IgG。另外，在实际操作时，有时会遇到一抗种属与样品相同，这时需额外注意样品是否含有内源抗体与二抗结合产生假阳性。
     
    物种 Clonality
    小鼠 IgA, IgD, IgE, IgG（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3） and IgM
    兔 IgA(IgA1, IgA2, IgA3, IgA4, IgA5, IgA6, IgA7, IgA8, IgA9, IgA10, IgA11, IgA12, IgA13, IgA14), IgE, IgG, and IgM
    山羊 IgA, IgE, IgG1, IgG2, IgE, IgM
    大鼠 IgA, IgD, IgE, IgG（IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG2c）and IgM
    鸡 IgY
    人 IgA, IgD, IgE, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), and IgM
     
    ∎呈色怎么选：
    市面上呈色方式有很多选择，但主要可归为两类
    1.酶呈色：如HRP辣根过氧化酶和AP碱性磷酸酶。western blot，组织免疫化学和ELISA常用酶标二抗。
    2.荧光染色（FITC, RRX, TR, PE）（如遇多染, 抗体选择来源或亚型不相同，荧光不相近) 细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞实验通常使用荧光基团标记的二抗。如果样品是低表达量，想要更大程度的放大检测信号，可以使用biotin/avidin检测系统。
     
    ∎二抗专一性：
    我的二抗认mouse IgG, 也会认到rabbit IgG吗?
    GeneTex推出交叉吸附型二抗，提高二抗专一性，通过不同物种抗体的固定基质管柱，过滤非专一性的二抗，减少二级抗体产生来自非目标抗体的交叉反应 (cross-reactivity)，有效增加其二抗的专一性。例如：GTX35185 Mouse IgG1 antibody, pre-adsorbed (HRP)
     
     
    4.在哪抓？哪种应用
     
    ∎做什么应用, 用什么抗体：
    WB, IHC-P, IHC-Fr, ICC, ELISA, IP实验环境不同，目标蛋白的折叠方式也不同，抗体与目标蛋白的结合能力也不一样，一个抗体不一定能适用于各种应用，有些抗体无法结合变性的蛋白(如下图)，这会在western blot出现糟糕的结果。因此挑选抗体时, 可先参考厂家的说明书，再通过网站的筛选功能快速找到需要的抗体。
     
    ▲说明：抗体辨识蛋白质直线型序列 (连续序列) 适用WB, IHC-P, IHC-Fr, ICC, ELISA, IP
     
    ▲说明：抗体辨识蛋白质结构型序列 (不连续序列) 适用IHC-P, IHC-Fr, ICC, ELISA, IP(做WB时，结构打开，无法结合变性蛋白)
     
    掌握以上挑抗体四個要诀，我们与对的抗体零距离！

     

  • 关于内参你该问的事

    什么是内参

    Western Blot常用来比较不同条件下或不同细胞组织中目标蛋白表达量的相对多寡，因此必须先确定上样量相同，才有比较的基础。在Western Blot实验中，可能因总蛋白浓度测定不准确；或是蛋白质上样时因操作产生误差，所以必须设置内部参照组来进行校正。此内部参照必须在不同细胞或组织间表达相对恒定，且有高水平的表达量，来确保不同样品间蛋白定量相同。而这样的参照蛋白，就称为内参，对应的抗体就称为内参抗体。

    内参在WB实验中的重要性

    1. 用于校正蛋白水平，确保不同样品间蛋白定量(上样量）相同。可从条带粗细初步判定上样量是否有差异。进一步，使用影像分析程序将目标蛋白量除以内参含量，所得到的数值即为校正后的目标蛋白相对含量，如此就可以进行目标蛋白相对量的比较。
    2. 确认转膜、显色等步骤是否均匀转移,呈色。内参一般选用高表达的蛋白，因此也可通过内参的条带, 观察WB实验中的转膜、显色等步骤是否有异常。
    3. 对文章发表绝对重要,增加实验的可信度。文章内放上内参的数据，较有说服力，文献审核者也会较相信实验数据。

    如何挑内参抗体

    通常会挑选各细胞或组织间稳定表达、并且不受实验影响的蛋白作为内参，但不同的实验还是有一些细节要注意，挑选内参可参考下面四点：

    研究的蛋白分子量?

    选择内参抗体时，应考虑分子量。内参蛋白最好能与目标蛋白的分子量有5 kDa以上的差异，在WB实验中能做区隔。分子量若太过接近，不利后续条带的分析。例如目的蛋白分子量为34 kDa，则可考虑选择分子量19 kDa 的Cofilin 1，不宜选择34 kDa GAPDH作为内参。

    Citation-Support KOKD-Validation Comparable Abs IP-MS Analysis
    Cyclin D1 antibody [N1C3] (GTX108624)

    Cyclin D1 antibody [N1C3] (GTX108624)
    Brachyury antibody (GTX133714)

    Brachyury antibody (GTX133714)
    		   

    研究的領域?

    挑选的内参是否会受实验变化影响，例如GAPDH是常用的内参，但在代谢糖酵解的研究中，可能就不适合做内参；在凋亡实验时，TBP、Lamin A + C等与凋亡相关的因子也不适合作为内参。内参最好是选择在正常状态和病理状态下表达没有明显差异的蛋白，这也是大家最容易忽略的一点。

    说明：创伤性脑损伤后，GAPDH显著降低，建议以beta actin做内参（PMID: 30077728）
     
    GAPDH antibody [GT239] (GTX627408)

    GAPDH antibody [GT239] (GTX627408)
    		   

    研究的材料?

    1. 哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、GAPDH、COX4、Histone H3等。
    2. 其他来源样本应该参照文献，选择合适的蛋白作为内参，例如植物样本可用bata actin，Ubiquitin，Rubisco作为内参

    是否使用亚细胞萃取?

    一般的蛋白检测常用β-actin、GAPDH抗体等，如针对核蛋白定量，常用的核内参抗体有Lamin B、Histone H3、PCNA。

    常用内参一览表

     

     

     

  • 三个WB遇黑点该做的事
  • 轻松拿取玻璃片的小技巧
  • 瞬间消除胶上气泡的小妙招
  • 蛋白质印迹技巧和窍门 | 样品制备

     

  • 蛋白质印迹技巧和窍门 | 电泳
    https://v.youku.com/v_show/id_XNTgwMDA4NDEwNA==.html?spm=a2hbt.13141534.app.5~5!2~5!2~5~5~5!2~5~5!2~5!2~5!2~5~5!2~A&scm=undefined.undefined.undefined
  • 蛋白质印迹技巧和窍门 | 加速您上样!
  • 蛋白质印迹技巧和窍门 | 半干转膜与抗体反应

     

  • 蛋白质印迹技巧和窍门 | 不可不知的NC膜保存法
  • WB技巧与问题排除