为了满足您的需求,请在购买前联系 sales@genetex.com或当地经销商以获取更多信息,我们将帮助您选择最佳产品进行实验。
Q4: 制备做western blot实验的蛋白质样品时,要考虑哪些参数?
Q6: 为什么western blot 上蛋白质的分子量(MW)与预测的MW不同?
有关具体建议,请参阅每个产品的说明书。通常,抗体可在4 ºC冷藏短期(1-2周)储存,如果存放时间较长,请将抗体分装,并保存在-20ºC或更低温的无霜冰箱中,避免反复冻融;如果储存不当,可能会影响产品的效能。
可根据实验的要求调节分装试样的体积,但是,由于小体积更容易受到外部温度的影响,我们建议分装试样要> 10 ul。
GeneTex在网站上提供常见应用的实验方法,尽管每个实验室都已经有自己的步骤,但仍然需要对每种抗体/试剂进行优化,请点击此处 click here 查看常规实验方法。
样品应在含有适当蛋白酶抑制剂(以及磷酸化靶目标磷酸酶抑制剂)的冰冷缓冲液中裂解,始终将样品保存在冰上并冷冻分装试样,以避免反复冻融。
GeneTex 无法保证稀释的抗体在重复使用时能够始终如一地发挥作用,这必须由研究人员凭经验进行测试。
蛋白质具有翻译后修饰、切割、同种型或聚合等作用,这些作用会影响跑胶时观测的分子量大小,甚至蛋白的氨基酸组成及构型也会影响。因此,根据感兴趣的蛋白质生物学,可能存在比预期更小或更大的特定条带。相关信息,请参阅我们对观测/预测MW的讨论。
GeneTex 无法保证抗体适用于未说明的物种或应用,为确保抗体符合您的需求,请在购买前联系 sales@genetex.com以获取更多信息。
GeneTex深知值得信赖的抗体是加速实验进行与实验具有再现性唯一且必须的工具,因此GeneTex使用各种验证方式来确认我们的抗体品质, 解决批次再现性与专一性问题,并依据2016年Nature Methods上发表的抗体特异性验证指南,将此五大策略纳入生产验证流程……
2016 年 Nature 子刊建议的 5 种抗体验证方式,即是挑选抗体的金标准。
五大验证包含基因敲除敲弱验证、比较抗体验证、免疫捕获与质谱分析、生物特性与正交策略、蛋白过表达策略等验证方式,说明如下:
利用CRISPR/Cas9或RNAi等技术,将目标基因敲除或敲弱以验证抗体对蛋白质表现量变化的信号反馈。
敲除(Knockout)使用 CRISPR/Cas9 将目标基因从整个基因组去除,使目标蛋白不表达,收取此 Knockout 细胞裂解液作为对照组,可确认抗体专一性。
敲弱(Knockdown)使用 siRNA 将目标基因静默,基因还在,但蛋白表达量降低甚至不表达。收取此 Knockdown 细胞裂解液作为对照组,可确认抗体专一性。
基因敲除敲弱验证就是取有表达蛋白的细胞裂解液,跟使用基因技术去除或减少蛋白的裂解液做比较,如果抗体专一性辨识蛋白,应该会出现一个样本有强条带,另一个样本弱(无)条带,如抗体无专一性则条带无变化。
CD44参与介导细胞存活的迁移、增殖、分化和信号传导途径。GTX628895抗体是小鼠单克隆抗体,使用基因敲除的细胞裂解液进行验证,可看到处理后条带消失,证实抗体特异性辨识 CD44 蛋白,适用多种应用,包括 WB、IHC-P、FACS 和 IP,且被多篇文献引用,为可靠的抗体工具。
CD44 antibody [GT462] (GTX628895) |
使用两种可识别目标蛋白表面不同抗原表位的独立抗体,并通过对比或定量分析确定特异性。相同靶标、相同处理的样品,理论上抗体辨识的条带位置应该相同。如不相同,可能有其一抗体辨识错误蛋白或是其他原因;另外也可以通过比较找到更高敏的抗体。
临床上 Her2 的检测多采用免疫组织化学法检测其表达水平,也是决定能否使用靶标治疗的依据之一。GTX100509 HER2/ERBB2 抗体使用两个不同的抗体进行比较(如下),确认有一致性的染色图谱,而 GTX100509(左)灵敏度甚至比其他厂家来的更高。
Her2 / ErbB2 antibody (GTX100509) |
利用IP/MS分析可直接捕获与抗体直接发生相互作用的目标蛋白以及其所形成的蛋白质复合物,将免疫捕获的目标蛋白进行质谱分析,可确认捕获的蛋白身份是否为目标蛋白,以此确认抗体是否辨识到对的蛋白。
GTX112864 PARP 抗体通过免疫捕获及质谱分析验证(PMID:30377371),可进行 WB、ICC/IF、IHC-P、IP、ChIP assay 等多种应用,GeneTex的“PARP antibody [N2C1], Internal”通过了五项“抗体验证支柱”的所有测试,证实其具高质量,高性价比,与高特异性的产品优势。此外,它已在多篇文献中被引用,在不同物种上均能进行DNA修复,基因组稳定性和细胞凋亡方面的研究。
比较抗体验证 |
生物特性与正交策略 |
基因敲除敲弱验证 |
免疫捕获及质谱分析 |
目标蛋白过表达 PARP antibody [N2C1], Internal (GTX112864) |
生物特性与正交策略是指利用目标蛋白质本身的生物特性作为基础进行定性与定量验证,或使用非抗体依赖方法(例如RNA表达量),检测基于抗体与生物特性或非抗体定量间的相关性,来验证抗体的专一性,包含:
当 KRAS 基因突变,细胞分裂将不受控制,形成肿瘤。其中 KRAS G12D 和 G12V 突变占这些变化的 75% 成为研究的热点。在市面上有许多 KRAS G12D 的抗体,选择抗体时可优先挑选经过验证的,如有组织染色的结果更佳,像是GeneTex 的兔重组单抗 GTX635362。GTX635362 RAS(G12D 突变体)抗体通过使用多种细胞及正常与癌组织对照进行正交策略验证;在人胰腺癌细胞系和 PDAC 小鼠模型的 RAS G12D 突变蛋白表现出高度的敏感性和特异性。右图为蛋白印迹(WB)和左图为免疫组化(IHC-P)。
RAS (G12D Mutant) antibody [HL10] (GTX635362) |
利用在细胞中过表达目标蛋白,并收取细胞裂解液后进行 WB 分析,理论上蛋白量增多,抗体辨识后的信号也会增强,因此可确认抗体是否特异性辨认正确蛋白,过表达目标蛋白可作为抗体验证的正控制组。
TET1蛋白一般在细胞内的表达量较低, 蛋白生命周期也短, 往往不易检测。这时可进一步使用过表达 TET1 的细胞裂解液作对照(下图 B),可看到抗体辨识的条带会明显增强,确定抗体辨识具有特异性。
TET1 antibody [N3C1] (GTX124207) |
五项验证要同时通过是非常困难的,主要受限于技术与材料,大部分的抗体验证仅能通过 1~2 项的验证,能同时通过 5 项验证可说是少之又少,GeneTex的GTX107678 NFkB p65抗体就是少数的例子之一,该抗体通过 5 项验证方法,并且全面验证 WB、ICC/IF、IHC-P、IP、EMSA,是目前唯一一个能同时通过 5 种验证的 NFkB p65 抗体。
基因敲除敲弱验证 |
比较抗体验证 |
生物特性与正交策略 |
目标蛋白过表达 |
注:【免疫捕获及质谱分析】验证数据请参考 Nat Methods 期刊(PMID:30377371)
GeneTex还有 GTX628887 EGFR 抗体和GTX112864、GTX112839 PARP 抗体抗体都是少数同时通过五种验证的例子。
EGFR antibody [GT133] (GTX628887) |
Western Blot遇到黑点,莫急莫慌莫害怕,只要掌握3个关键问题, 就能完美呈现漂亮Western Blot! | ||||||||||
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一样米, 养百人, 同样做WB为什么我的结果总和别人不一样? | ||||||||
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爱情忌讳拖拖拉拉, 拖拉的条带也让人心里不快, 怎样可以给个痛快呢?用下面的方式即可解决。 | ||||||||||||||||||||||||||||
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扭曲的线条在艺术上, 可以成为毕卡索 扭曲的线条在WB上, 总是让人不好说 | ||||||||||||
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Western Blot遇到高背景, 就像深山云雾, 有那么一点朦胧美, 却又想扒开云雾,一窥究竟。遇到高背景,只要掌握4个关键,即可烟消云散条带出。 | |||||||||||
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1条2条3条, 到底哪一条是我的目标蛋白?非专一性条带看似复杂, 但只要使用注意2方向6小点, 就能找出问题, 快速解决。 | |||||||||||||||||||||||
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「文献说这目标蛋白应该染在细胞质, 怎么我就染在细胞核, 到底哪里出错呢?」相信这是许多人做细胞染色会遇到的问题, 染色不仅要染的漂亮, 还要染对, 没有些技巧可是很容易失败的。
免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)为常用的实验方法,主要样品为细胞,因常使用荧光标记所以在应用上常常写成ICC/ IF。相对的,免疫组织化学(IHC)样品为组织,可使用荧光或化学方式呈色。细胞免疫染色步骤如上图,需将细胞固定在盖玻片上经过通透、一二抗染色等步骤, 最后成像拍照。当ICC染色定位不正确怎么办呢?莫急莫荒莫害怕 1. 可检查细胞爬片与2. 检查固定与通透。
ICC型态不佳/信号定位不正确怎么办呢? 检查这2件事,一切都搞定!
a.盖玻片处理: 通常细胞在盖玻片上黏附能力都不强,可以使用几种成分铺在盖玻片上,以增强细胞与玻璃盖玻片的黏附,常用的溶液成分如下表,不同的细胞需进行个别的调整,以得到最佳的结果。
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b.细胞状态和细胞密度: 细胞的健康状态、型态与密度,可能会影响靶标蛋白的表达与定位,一般使用分盘后培养隔夜(时间太短细胞贴附不完全,太长细胞会太老不健康),细胞密度约50-70 %的爬片,密度太高或太低都可能对靶标蛋白的定位产生负面的影响,需要根据靶标特性调整适宜的细胞类型与密度,例如在研究细胞连接标记蛋白时,维持细胞与细胞间的接触就特别重要,选择较容易观察到细胞连接的细胞种类,最佳细胞密度也要有80%以上。
c.细胞培养条件: 有些靶标蛋白的表达和定位,随着细胞周期或细胞应激反应而变化,须确保用来制作爬片的细胞状态为观察靶标蛋白的最佳条件,例如观察细胞分裂相关蛋白,可将细胞做同步处理,使细胞处于同一个细胞周期阶段,否则就需要在细胞爬片中仔细观察靶标蛋白的信号,又如观察自噬反应中的LC3B蛋白,如未加入诱发细胞展开自噬的药物,将较难观察到正确的定位结果。
a.分盘时,将细胞悬浮溶液接种于涂层处理过的盖玻片上,接着即可比照黏附型细胞的实验步骤。
b.在细胞悬浮溶液中进行完固定步骤,利用细胞离心技术(CytospinTM)将细胞低速离心至涂层处理过的盖玻片上,也可以用移液管吸取细胞悬浮液滴于已涂层的盖玻片上。
c.在悬浮状态中进行完所有染色步骤,最后用移液管移至器皿或载玻片上进行显微镜成像。
d.小星狮小技巧: 可以将固定后的悬浮细胞溶液与2-3 % 的琼脂等比例混合,将细胞检体包覆,待琼脂胶体凝固后,再按照常规的脱水、包埋程序做石蜡包埋,制作成的细胞蜡块,之后再进行组织切片,此玻片样本可照一般石蜡组织切片IHC的操作方法进行免疫化学染色,与一般ICC最大的不同为: 此组织蜡块制作的玻片需烤过,再进行脱蜡与回水,也需要进行抗原修复的步骤,基本上是当作IHC进行实验,对于较难得到的细胞样本(如病毒感染的细胞),可用此方法保存细胞蜡块,日后若有需要只要进行切片即有样本。
样品的固定与通透对实验结果影响很大,最适合的固定与通透方法,与细胞类型、靶标蛋白和使用的抗体有关,尝试不同的固定和通透条件,将有助于得到靶标蛋白在抗体染色的最佳信号与正确定位。
a.固定剂的选择: 固定剂主要有两大类,交联剂(如多聚甲醛)与有机溶剂(如甲醇或丙酮),交联剂通过疏水性交联把蛋白与蛋白连起来,有机溶剂能使细胞脱水,把蛋白质沉淀在细胞结构上,也具有细胞通透的性能,多聚甲醛、甲醇和丙酮等都是很常用的固定剂,建议最初从4% PFA,固定15分钟开始尝试,倘若没有达到预期效果,再调整固定时间或更换另一种固定剂,GeneTex在固定剂的使用经验整理如下表,但仍须根据靶标蛋白或抗体的不同逐步调整出最佳方案。
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b.通透条件的选择: 由于抗体无法直接穿过数十微米的细胞质膜进入细胞,因此,检测胞内的靶标蛋白时,需进行通透化处理,利用除垢剂在细胞膜形成孔洞,使得抗体得以进入细胞内,常用的除垢剂有Triton® X-100, NP-40, Tween 20或皂甘等,建议从0.1 % Triton® X-100,通透5分钟开始尝试,倘若没有达到预期效果,再调整通透时间或通透剂浓度,也可以考虑更换另一种通透剂,有机溶剂固定剂会引发细胞变性脱水,因此也会破坏细胞膜的完整性,较不适合细胞膜靶标蛋白染色,一般来说,有机溶剂固定之后也不建议进行细胞通透的步骤,最佳的细胞通透方法,一样需要根据靶标蛋白与所使用的抗体而调整,无法用一种方法套用到所有的实验。
良好的实验设计是获得准确科学实验数据的关键,设计正确的同型对照抗体,可以优化实验的结果和去除假阳性,使数据可进一步统计与分析。究竟什么是同型对照呢?我们从抗体开始讲起。
抗体(Ab)也称为免疫球蛋白(immunoglobulin ,简称Ig),是一种由B细胞分泌的大分子Y字型蛋白,被免疫系统用来中和细菌、病毒等病原体。抗体「Y」的基本单元为两个大的重链(~50 kDa)和两个小的轻链(~25 kDa),两条重链和两条轻链通过二硫键连接,组成约150 kDa的免疫球蛋白单体(图一)。每条重链或轻链都由两个区域组成: 恒定区域(C)和可变区域(V)(如图二)。可变区位于「Y」末端的轻链和重链上,不同抗体之间,此区氨基酸序列差异很大,使抗体具有结合并中和抗原的特性;恒定区在同类别的抗体分子中具有相似的氨基酸序列,主要功能是和补体结合与FcR (Fc受体)相互作用。若使用木瓜蛋白酶可将抗体切割产生两个部分,一个是包含抗原结合位置的Fab (抗原结合片段);另一个是包含部分恒定区的Fc (抗体可结晶片段)。Fab是抗体上与抗原结合的区域,它由重链和轻链各自的一个恒定区和一个可变区组成,这些结构域在单体的氨基酸末端形成抗原结合位置;Fc是抗体的尾端,与称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的一些蛋白质相互作用,使抗体可以激活免疫系统。
(图一) |
(图二) |
抗体有许多不同的种类,在胎盘哺乳动物中(如人类与小鼠),有五种类别(isotype或class)的抗体,称为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE (图三),他们各自以「Ig」为前缀命名,代表免疫球蛋白,「Ig」之后表示抗体不同类型的重链,特定类别的表达通过与不同免疫效应细胞上的Fc受体分子的特异性结合来确定抗体的功能(表一),而相同类别也可能存在不同的亚类,如在人类中,IgG具有四种亚类IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,它们对于鉴定和清除肽和多糖抗原至关重要。
(图三) |
(表一) |
在实验中,抗体除了与抗原结合外,由于Fc受体或其他蛋白质相互作用,抗体可能以非抗原依赖方式结合,因此确保信号为抗体-抗原特异性结合所产生非常重要。
同型对照指使用与特异性一抗相匹配的抗体作为对照组,此抗体包括种属、亚型,重链和轻链的类型甚至标记物、浓度应该与特异性一抗相同,但不会辨识特异性蛋白的抗体。同型对照是阴性对照,在使用单克隆抗体(mAb)做研究时,为了准确测量抗体的作用和功效,需使用同型对照以确认信号不是与Fc受体或其他非特异性蛋白结合所产生,让研究人员能够准确的区分非特异性背景信号和特异性抗体信号。一般而言,抗体在结构上彼此非常相似,在抗体分子的「恒定区」(图二),同类型的抗体彼此序列更是高度保守,然而,单抗的高度可变区只要一个小改变就可以影响抗原的特异性结合。在研究中使用抗体进行测试时,需要控制任何可能影响研究结果的变量,抗体恒定区和Fc区的非特异性结合,这些因素可能会对单抗结果产生影响,因此,在实验设计中需要考虑这些因素,使用匹配的同型对照(具有与测试单抗相同的宿主物种、同型、标记物、轻链和浓度),以判断这些变量,进行校正与精确的数据分析。相较于以PBS做对照,PBS这样简单的阴性对照无法判断上述变因造成的影响,从而出现误导性数据。
1.流式细胞实验 (FACS): 流式细胞仪可对细胞进行定量分析和分选,抗体是否特异性结合影响最终的实验数据。在流式实验中,抗体可通过与Fc受体或其他蛋白质结合而产生非特异性信号,由于Fc受体的表达随组织细胞类型不同而变化,这种非特异性信号可能产生假阳性,从而混淆了研究结果,此时使用同型对照可确保信号的真僞。匹配的同型对照应能模仿这种非特异性结合和信号,这与使用PBS (无结合)不同。阴性对照应匹配种类、重链、轻链、所需的荧光标记物等,由于这种复杂性,流式细胞实验中使用的同型对照抗体较难挑选也常常引起争议。
2.免疫组织化学染色(IHC):做免疫组化实验时,抗体除了与特异性蛋白结合外, 也有可能与组织上的Fc受体结合,导致非特异性染色结果(如图四)。同型对照是免疫组化的重要阴性对照组,一般可使用与一抗相同的同种型和浓度作为同型对照。有时,也会使用二抗或与一抗相同物种的多克隆抗体库染色做阴性对照,然而,使用二抗做对照组无法呈现一抗所造成的背景值,二抗同种型也可能导致染色上的差异;若使用多克隆抗体库做阴性对照进行染色,此抗体库为免疫球蛋白的混合物,可能存在与多种不同靶标结合的风险,而增加背景和非特异性染色。因此,这两者模式与同种型抗体对照不同,不能完全取代。
(图四) |
研究级同型对照抗体适用于基础研究实验,例如免疫组化、免疫沉淀(IP)、流式细胞术、ELISA和蛋白质印迹(WB)。然而,因同型对照抗体无法测量内毒素和纯度,并且包含防腐剂,因此不用在体内实验。在进行实验时可依应用选择适当的一抗,对应(表二)挑选经验证高质量的同型对照,将比二抗或PBS更容易判断一抗是否造成背景值。
(表二) |
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1.要抓谁?目标蛋白特性 | |||||||||||||||
挑选抗体时要先了解目标蛋白特性,才能挑选到适当的抗体。蛋白的特性可从物种、修饰化、亚型、抗原区段、生理环境五个方面进行确认。 | |||||||||||||||
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▲说明:抗体辨识蛋白质直线型序列 (连续序列) 适用WB, IHC-P, IHC-Fr, ICC, ELISA, IP | |||||||||||||||
▲说明:抗体辨识蛋白质直线型序列 (连续序列) 适用WB, IHC-P, IHC-Fr, ICC, ELISA, IP | |||||||||||||||
▲说明:抗体说明书可查找抗体辨识的抗原区段(GTX104763, PD-L1 antibody)。 | |||||||||||||||
GTX104763 PD-L1 antibody | |||||||||||||||
▲说明:只辨识PD-L1,不会认到PD-L2 另外,如研究主题为切割后的活性蛋白,也可查看抗体是否是辨识活化后的蛋白。 | |||||||||||||||
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2.谁去抓?一抗特性 | |||||||||||||||
确认目标蛋白信息后,接着可从验证方式与纯化方式来了解抗体的质量。 | |||||||||||||||
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3.被谁抓?二抗特性 | |||||||||||||||
二抗可与一抗结合,其后接有酶标或荧光素呈色,可用来放大讯号。二抗挑选要注意与一抗配对,呈色和交叉反应。 | |||||||||||||||
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4.在哪抓?哪种应用 | |||||||||||||||
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掌握以上挑抗体四個要诀,我们与对的抗体零距离! | |||||||||||||||
Western Blot常用来比较不同条件下或不同细胞组织中目标蛋白表达量的相对多寡,因此必须先确定上样量相同,才有比较的基础。在Western Blot实验中,可能因总蛋白浓度测定不准确;或是蛋白质上样时因操作产生误差,所以必须设置内部参照组来进行校正。此内部参照必须在不同细胞或组织间表达相对恒定,且有高水平的表达量,来确保不同样品间蛋白定量相同。而这样的参照蛋白,就称为内参,对应的抗体就称为内参抗体。
通常会挑选各细胞或组织间稳定表达、并且不受实验影响的蛋白作为内参,但不同的实验还是有一些细节要注意,挑选内参可参考下面四点:
选择内参抗体时,应考虑分子量。内参蛋白最好能与目标蛋白的分子量有5 kDa以上的差异,在WB实验中能做区隔。分子量若太过接近,不利后续条带的分析。例如目的蛋白分子量为34 kDa,则可考虑选择分子量19 kDa 的Cofilin 1,不宜选择34 kDa GAPDH作为内参。
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挑选的内参是否会受实验变化影响,例如GAPDH是常用的内参,但在代谢糖酵解的研究中,可能就不适合做内参;在凋亡实验时,TBP、Lamin A + C等与凋亡相关的因子也不适合作为内参。内参最好是选择在正常状态和病理状态下表达没有明显差异的蛋白,这也是大家最容易忽略的一点。
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一般的蛋白检测常用β-actin、GAPDH抗体等,如针对核蛋白定量,常用的核内参抗体有Lamin B、Histone H3、PCNA。
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